1. 제목( Subject ) : PlasmidDNApurification and 전기영동(Electrophoresis)
2. 실험목적(purpose)
미리 배양된 E.coli를 plasmidDNA를 purification 하고 이것을 Agarose Gel 전기영동을 통해 분리하여 확인한다.
3. 재료 및 기구 ( Material and Apparatus )
pippet, plasmidDNA, rack, pippet tip, centrifuge(미량원심분리기), 전기영동장치, comb, LB(
DNA와 같이 전기영동 될 때, DNA가 움직인 정도를 알 수 있게 하는 역할을 한다.
③ 전기영동 buffer
TAE (Tris-acetate EDTA):DNA분자량이 큰 경우, agarose electrophorsis 에서 쓴다.
TBE (Tris-borate EDTA):DNA분자량이 작은 경우, DNA sequencing에 쓰인다.
4. Materials & Equipments
Restriction enzymes(BamHⅠ, NdeⅠ), pET-14b plasmid, FabG gene
1. Object
제한효소 활용 및 Ligation, 전기영동, plasmid prep. 등의 여러 실험을 통해 Gene cloning의 전반적인 실험 및 이해를 하고, PCR의 기초적인 간단한 실험을 함으로써 DNA와 유전자를 다루는 molecular biology에서의 이론적 측면뿐만 아니라 실험적인 측면 또한 함양한다.
2. Date
실험기간: 2011년 11월 7일 –
◆실험 첫째날 2011년 10월 24일 월요일
▶원리
1 Restriction enzyme 처리
- 이 실험에서 우리는 아무 처리되지 않은 plasmid와 foreign gene을 plasmid에 삽입하여 만든 inserted plasmid에 각각 제한효소를 처리하는 실험을 했다.
- 제한효소란 DNA의 특정한 염기서열을 인식하고 인식부위 또는 그 근처의 특정 이중사
buffer는 gel이 살짝 잠길 정도로 붓는다.)
④ 2 µl의 100bp DNA ladder를 loading하여 DNA size marker로 사용한다.
⑤ 확인하고자 하는 plasmidDNA를 차례로 DNA loading buffer(1 µl)와 섞은 후, 각각의 well에 loading한다.
⑥ 75V 전압에서 전기영동을 하여, DNA가 충분히 분리되도록 한다. (Loading buffer의 이동위치 관찰)
DNA를 제한효소로 잘라서 활성을 없애는 동시에 자신의 DNA는 보호하기 위해 자신(생물체)의 DNA는 제한효소가 절단부위를 감지하지 못하게 하기 위해서 특정 염기서열이 메틸화 한다(Methylation).
Restriction enzyme은 다양한 cut sites를 가진다. 이번 우리가 실험할 때 쓰게 될 restriction enzyme은 BamHⅠ 부위와 NdeⅠ
및 Interphase가 잘 형성되게 해준다
Isoamyl alcohol
실험 시 거품이 생기는 거 방지 및 Interphase 형성 도움
Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol = 25 : 24 : 1 또는
Phenol : Chloroform = 1 : 1 로 만들어서 사용
이 방법을 통해서 단백질 등을 한번 더 제거하여 순도 높은 DNA를 얻을 수가 있다
추 후 Purification 과정 필요
DNA가 충분히 분리되도록 한다(DNA의 경우는 인산기에 있는 negative charge가 gel의 positive charge쪽으로 움직이게 한다. 이동속도는 DNA크기 모양에 따라 다르기 때문에 종류에 따라 분리된다).
7. 전기영동이 끝난 후 UV trans-illuminator에서 DNA band를 확인한다.
Gel Purification
1. UV로 확인한 Agarose gel의 DNA band를 잘
실험1 [Digestion of DNA with Restriction Enzyme]
실험준비물 :
Materials-restriction enzymes (ndeⅠ,BamhⅠ), restriction enzyme reaction buffer, DDW
Equipments-water bath, brief centrifuge
Procedure :
① e-tube를 두 개 준비하여, 각각 plasmid only와 inserted plasmid를 5μl 넣고, DDW 2μl,10x reaction buffer, 제한효소를 각각 1μl 넣는다. 제한효소를 가
◈ Observation & Result
Ligased plasmid + 만든 CP Cell
Ligation + 상용 CP cell
Inserted plasmid + 상용 CP Cell
Plasmid only + 상용 CP cell
실험5 Subject Transformant 확인/ LB Broth에 (containing 100μg/ml of ampicillin) transformant를 multiplication
◈ Purpose
전날 만든 transformant가 제대로 배양되었는지 colony를 확인하고, ampicillin을 처리해